Identification and purification of a specific and immunogenic antigen of the laminated layer of the hydatid cyst and production of an antigen-specific monoclonal antibody.

Authors

Abstract

Cystic echinococcosis (CE) is an infection caused by the larval stage of Echinococcus granulosus. This is widely distributed through Iran, where a variety of animals act as intermediate host. The immunogenic antigens (Ag) of different compartments of the hydatid cyst have been already determined. One of these compartments is the laminated layer (LL). We have extracted a protein with the MW of 24 kDa from a lysate prepared from the LL and produced a monoclonal antibody (mAb) against this protein. Five mAb named P3F6s, P2H4s, P1A6s, P1C3s, and P1F7s have been produced. The isotype analysis showed that P3F6s is IgG1 and the rest are IgM. P3F6s was purified from the ascitic fluid of mice injected with P3F6s hybridoma intraperitoneally. Western blot and ELISA analysis showed that this mAb could recognize the purified 24 kDa prepared from lysate of LL. Since a 24 kDa protein has been shown to be an immunogenic Ag, this protein can be used as a candidate for the development of diagnostic tests and vaccine strategies. For these aims, P3F6s can be used for the purification of this 24 kDa protein.

Article Title [فارسی]

تشخیص و خالص سازی آنتی ژن ویژه و ایمونوژنیک لایه مطبق کیست هیداتیک و تولید آنتی بادی منوکلونال علیه این آنتی ژن

Authors [فارسی]

  • رامین فرهودی
  • سید حسین حسینی
  • محمد رضا سیاوشی
  • محسن ابوالحسنی
  • پرویز شایان
  • امیر نژاد مقدم
Abstract [فارسی]

سیستیک اکینوکوکوزیز عفونت مرحله نوزادی اکینوکوکوس گرانولوزوس است که بطور گسترده در تمام ایران انتشار دارد. تاکنون ترکیبات آنتی ژنیکی قسمت های مختلف کیست هیداتیک مورد مطالعه قرار گرفته است. یکی از قسمت های کیست هیداتیک لایه رشته ای است . تولید آنتی بادی منوکلونال ابزار ارزشمندی جهت جداسازی و مشخص نمودن اپی توپهای مولکول آنتی ژنیک است. در این مطالعه از این روش برای جدا سازی و مشخص نمودن پروتئینی با وزن 24 کیلو دالتون از لایه رشته ای به منظور ایمن نمودن ونیز تشخیص هیداتیدوز استفاده نمودیم .عصاره لایه مطبق از کیست هیداتیک تهیه گردید. پروتئین 24 کیلودالتونی از ژل توسط Electro-Eluter استخراج و آنتی بادی منوکلونال علیه آن تولید گردید. برای غربال گری آنتی بادی های منوکلونال تولید شده ازروش الیزا غیر مستقیم استفاده شد. سپس پروتئین های لایه مطبق توسط 10% SDS-PAGE مجزا و با استفاده از سیستم semi- dry horizontal electro-transfer به روی کاغذ نیترو سلولز بلات گردید. MAb P3F6s توسط ستون پروتئین G-Sepharose خالص گردید و سپس به Sepharose-4B فعال شده با برومید سیانوژن متصل گردید. آنتی ژن لایه مطبق هنگام عبور از ستون افینیتی جدا گردید. در نهایت افینیتی آنتی بادی منوکلونال تولید شده اندازه گیری گردید. فیوژن سلولهای میلومایSP2/0 با سلول های طحال موشهای BALB/c ایمن شده، پنج هیبریدومای اختصاصی علیه پروتئین 24 کیلودالتونی لایه مطبق ایجاد کرد(,P3F6s P2H4s , P1A6s , P1C3s , P1F7s). آنتی بادی مترشحه توسط P3F6sاز کلاس IgG1 و بقیه از کلاس IgM بودند.پس از خالص کردن آنتی بادی منوکلونال P3F6sاز مایع آسیت توسط ستون پروتئین G-Sepharose و اتصال آن به Sepharose-4B فعال شده با برومید سیانوژن ،آنتی ژن 24 کیلو دالتونی از عصاره خام لایه مطبق و وزن مولکولی آن توسط SDS-PAGE تائید گردید.در نهایت ثابت اقینیتی (Kaff) آنتی بادی محاسبه گردید. بر اساس نتایج این مطالعه پروتئین 24 کیلو دالتونی لایه مطبق کیست هیداتیک که فقط توسط این لایه ترشح می شود،می تواند به عنوان یک پروتئین جدید درمطالعات آتی در زمینه ایمنیزاسیون دامها علیه هیداتیدوز مورد استفاده قرار گیردو همچنین در تست های تشخیصی با حساسیت بالا و اختصاصی برای تشخیص هیداتیدوز انسانی به کار رود.