Detection of single Dactylogyrus spp. in DNA extracted from infected gill tissue of fishes using Polymerase Chain Reaction

Authors

1 گروه بهداشت و بیماریهای آبزیان

2 گروه انگل شناسی

Abstract

Dactylogyrus spp. are monogenean worms found mostly as ectoparasites on the gills of several fish species, including carp and goldfish. These parasites are commonly detected by microscopic analysis of the gill lamellae, but this is time-consuming and technically difficult. In contrast to this conventional method, molecular techniques provide specific, sensitive and safe detection of parasites. In the present study, polymerase chain reaction (PCR) and subsequent DNA sequencing were used to detect Dactylogyrus spp. Specific common primers were designed to amplify the ITS-1 region of the rRNA gene of Dactylogyrus spp. Dactylogyrus worms were collected from 100 goldfishes and identified using a dissection microscope. Then, single worms were used for DNA extraction. To evaluate the PCR, a single parasite was added to a parasite-free gill, which then had its DNA extracted. Subsequently, the PCR products were purified and sequenced. Comparison of the nucleotide sequences of the PCR products with GenBank sequences showed that there was 100% homology with sequences from two Dactylogyrus spp., namely Dactylogyrus vastator and Dactylogyrus dulkeiti (registered under accession numbers AJ 564159 and AJ 564126, respectively). The results obtained from sequence analyses were consistent with species identification by microscopy. Therefore, the results show that it is possible to develop a sensitive and precise PCR method for the detection of Dactylogyrus-infected fish using DNA extracted from the whole gill.

Keywords


Article Title [فارسی]

شناسایی انگل داکتیلوژیروس تک در استخراج DNA از بافت آبشش آلوده ماهی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز

Authors [فارسی]

  • hosseinali mousavi 1
  • حسینعلی ابراهیم زاده موسوی 1
  • پرویز شایان 2
  • مهدی سلطانی 1
  • الهه ابراهیم زاه 2
  • مینا رستمی 1
Abstract [فارسی]

داکتیلوژیروس ها یک مونوژن است که به عنوان انگل خارجی آبشش، چندین گونه از ماهیان مانند کپور وحوض را آلوده می کنند. معمولی ترین روش شناسایی این انگل ها، بررسی میکروسکوپی لاملاهای آبشش است که روشی وقت گیر و دشوار می باشد. در مقابل به کارگیری تکنیک های مولکولی روشی اختصاصی وحساس تر جهت تشخیص انگل ها محسوب می شوند. در این مطالعه، روش PCR و تعیین توالی برای تشخیص گونه های داکتیلوژیروس استفاده گردید. بدین منظور پرایمرهایی از ناحیه ITS-1 ژن RNAریبوزومی انگل برای تکثیر DNAگونه های مختلف انگل های داکتیلوژیروس طراحی گردید. سپس69 عدد انگل داکتیلوژیروس از 100 ماهی حوض به روشهای میکروسکوپی جدا گردید و به دنبال تعیین گونه انگل با روش میکروسکوپی، استخراج DNA از هر یک از انگل ها انجام شد. به منظور ارزیابی توانایی PCR طراحی شده برای تشخیص انگل در بافت آبشش، استخراج DNA از انگل ها به همراه بافت آبشش نیز انجام گردید. به علاوه PCR بافت آبشش عاری از انگل، به عنوان کنترل منفی انجام گردید. در مرحله بعد محصولPCR تخلیص و تعیین توالی گردید. اندازه محصول PCR برای گونه های مختلف داکتیلوژیروس 532 جفت باز بود. بدنبال تکثیر DNA تخلیص شده از بافت آبشش حاوی انگل داکتیلوژیروس نیز محصول PCR با اندازه 532 جفت باز مشاهده گردید اما هیچ گونه محصولی به دنبال PCR بافت آبشش عاری از انگل مشاهده نگردید. بدنبال مقایسه توالی نوکلئوتیدهای محصولاتPCR با توالی نوکلئوتیدهای موجود در GenBank، 100 درصد تشابه با دو گونه داکتیلوژیروس واستاتور و داکتیلوژیروس دولکایتی مشاهده گردید. نتایج بدست آمده از روش ملکولی کاملاً مشابه نتایج حاصل از بررسی های میکروسکوپی بود. بنابراین، نتایج حاصل نشان می دهد که امکان استفاده از روش های مبتنی بر PCR، برای شناسایی ماهیان آلوده به داکتیلوژیروس از طریق استخراج DNA به طور مستقیم از کل بافت آبشش آلوده به داکتیلوژیروس وجود دارد.