Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliA and fliB in bovine Clostridium chauvoei isolates

Document Type: Infectious agents- Diseases- Surgery

Authors

1 Department of Anaerobic Bacterial Vaccines Research and Production, Razi vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

2 Department of Biotechnology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

Abstract

Background: Clostridium chauvoei is the etiological agent of blackleg as an endogenous infection in cattle.  Flagella have been known to play a critical role in the protective immunity of animals to clostridial infections. C.chauvoei has two copies of fliC gene, namely fliA and fliB. OBJECTIVES: The aim of this study was the determination and nucleotide sequence analysis of both copies of fliC genes in vaccinal strain and Iranian C. chauvoei isolates. METHODS: Six specific primers for amplification of fliA, fliB, and flagellin (fliC) genes were designed by Oligo software. Polymerase chain reaction was performed to amplify a fragment of 700 bp for both copies of flagellin (fliA and fliB) genes. The nucleotide percentage identity and divergence among isolates were deduced using BlAST and MegAlign softwares. RESULTS: It was found that divergence in fliB was more than fliA by sequence alignment analysis.  Six highly conserve regions, thirty-one SNPs and 13 amino acid polymorphisms were found in fliC gene (between fliA and fliB sequences) of Iranian C. chauvoei isolates. In comparative analysis, genomic similarity of the fliA and fliB genes between the vaccinal strain and examined field isolates was proved to be as high as 97.3 % and 98.2%, respectively. CONCLUSIONS: The fliC copies were identified as excellent biomarkers to study the molecular epidemiology and strain diversity among C. chauvoei isolates. The existence of genetic variation between two alleles of fliC gene in C. chauvoei is reported for the first time in Iran. In spite of some genetic variations, the immunologic cross protection test showed a high protection power of the local vaccine (produced by Razi Institute) against homologous and heterologous challenge.

Keywords


Article Title [Persian]

تعیین توالی و آنالیز مقایسهای ژنهای فلاژلین FliA و FliB در جدایههای گاوی کلستریدیوم شوای

Authors [Persian]

  • احمدرضا جباری 1
  • خلیل عزیزیان 1
  • مجید اسمعیلی زاد 2
1 بخش تحقیق و تولید واکسن های باکتریایی بی هوازی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران
2 بخش بیوتکنولوژی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران
Abstract [Persian]

زمینه مطالعه:  کلستریدیوم شوای عامل شاربن علامتی است که بعنوان یک عفونت درونزا در گاو شناخته شده است. فلاژلین (liC) بعنوان عامل اصلی در ایجاد ایمنیت حفاظتی در دامها علیه عفونتهای کلستریدیایی نقش دارد. کلستریدیوم شوای دو کپی از ژن فلاژلین ( fliC) که fliA و fliB نامیده میشوند را دارا میباشد. هدف: تعیین توالی و آنالیز نوکلئوتیدی هر دو کپی ژن fliC در سویه واکسینال و جدایههای فیلدی کلستریدیوم شوای هدف این مطالعه بوده است. روش کار: شش پرایمراختصاصی برای تکثیر ژن فلاژلین و دو کپی آن با استفاده از نرم افزار الیگو طراحی گردید. واکنش زنجیرهای پلیمراز بمنظور تکثیر یک قطعه 700 جفت بازی برای هر دو ژن fliA و fliB بکار گرفته شد. درصد تشابه و اختلاف نوکلئوتیدی بین جدایهها با استفاده از نرم افزارهای BLAST و MegAlign محاسبه گردید. نتایج: یافتههای آنالیز توالیهای نوکلئوتیدی نشان داد که میزان تنوع در ژن fliB بیشتر از fliA میباشد. شش ناحیه کاملاً حفاظت شده، سی و یک تغییر تک نوکلئوتیدی، سیزده اختلاف اسید آمینهای در ژن fliC جدایههای ایرانی کلستریدیوم شوای شناسایی گردید. مقایسه توالی نوکلئوتیدینهای fliA و fliB، نشان داد که قرابت سویه واکسینال با جدایههای فیلدی به ترتیب 3/97 و 2/98٪ میباشد. نتیجهگیرینهایی: کپیهای ژن fliC بعنوان مارکرهای خیلی مناسب برای مطالعات اپیدمیولوزیک و شناسایی تنوع در جدایههای کلستریدیوم شوای شناخته شد. وجود تنوع ژنتیکی در بین دو آلل ژن fliC برای اولین بار از ایران گزارش میشود. علی رغم وجود تفاوتهای ژنتیکی مذکور، آزمایش ایمنیت متقاطع قدرت حفاظت واکسن تهیه شده از سویه بومی (توسط موسسه رازی) را در چالنج با سویههای همولوگ و هترولوگ نشان داد.

Keywords [Persian]

  • کلستریدیوم شوای
  • فلاژلین
  • پلی مورفیسم
Alm, R.A., Guerry, P. (1993) Distribution and polymorphism of the flagellin genes from isolates of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni. J Bacteriol. 175: 3051-3057.

Ardehali, M., Darakhshan, H. (1975) Isolation and characterization of Clostridium chauvoei strains isolated from cases of blackleg in cattle in Iran. Arch Razi  Inst. 27: 37-41.

Ardehali, M., Darakhshan, H., Moosawi M. (1984) The existence and present situation of clostridial diseases of domestic animals in Iran. Arch Razi Inst. 34: 27-32.

Attridge, S., Rowley, D. (1983) The role of the flagellum in the adherence of Vibrio cholerae. J Infect Dis. 147: 864.

Bagge, E., Lewerin, S.S., Johansson, K. (2009)Detection and identification by PCR of Clostridium chauvoei in clinical isolates, bovine faeces and substrates from biogas plant. Acta Vet Scand. 51: 8.

Blood, D.C., Radostitis, O.M., Henderson, J.A. (1983) Veterinary Medicine: A Textbook of the Diseases of Cattle, Sheep, Goats and Horses. (6th ed.) Bailliere Tindall, oxford, London, Uk. Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P.A.D. (1998) Restriction fragment length polymorphism analysis of some flageelin genes of Salmonella enterica. J Clin Microbiol. 36: 2835-2843.

Ji, W.S., Hu., J.L., Qiu, J.W., Peng, D.R., Shi, B.L., Zhou, S.J., Wu, K.C., Fan, D.M. (2001) Polymorphism of flagellin A gene in Helicobacter pylori. World J Gastroentrol. 7: 783-787.

Joys, T.M. (1988) The flagellar filament protein. Can J Microbiol 34: 452-458.

Kojima, A., Uchida, I., Sekizaki,T., Sasaki, Y., Ogikubo, Y., Kijima, M. (2000) Cloning and expression of a gene encoding the flagellin of Clostridium chauvoei. Vet Microbiol. 76: 359-372.

Kojima, A., Uchida, I., Sekizaki, T., Sasaki, Y., Ogikubo, Y., Tamura, Y. (2001) Rapid detection and identification of Clostridium chauvoei by PCR based on flagellin gene sequence. Vet Microbiol. 78: 363-371.

Kostrzynska, M., Betts, J.D., Austin, J., Trust, T.J. (1991) Identification, characterization, and spatial localization of two flagellin species in Helicobacter pylori flagella. J Bacteriol. 173: 937-946.

Macnab, R.M. (2004) Type III flagellar protein export and flagellar assembly. Biochim Biophys Acta. 1694: 207-217.

Miyashiro, S., Nassar, A., Souza, M., Carvalho, J., Adegas, J. (2007) Identification of Clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of PCR. Braz J Microbiol 38: 491-493.

Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. (1985) Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131: 1973-1980.

Reid, S.D., Selander, R.K., Whittam, T.S. (1999) Sequence diversity of flagellin (fliC) alleles in pathogenic Escherichia coli. J  Bacteriol. 181: 153-160.

Sasaki, Y., Kojima, A., Aoki, H., Ogikubo, Y., Takikawa, N., Tamura, Y. (2002) Phylogenetic analysis and PCR detection of Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi types A and B, and Clostridium septicum based on the flagellin gene. Vet Microbiol. 86: 257-267.

Tamura, Y., Tanaka, S. (1984) Effect of antiflagellar serum in the protection of mice against Clostridium chauvoei. Infect Immun. 43: 612-616.

Tanaka, M., Hirayama, N., Tamura, Y. (1987) Production, characterization, and protective effect of monoclonal antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infect Immun. 55: 1779-1783.

Tino, T. (1977) Genetics of structure and function of bacterial flagella. Annu  Rev Genet. 11: 161-182.

Uzal, F.A., Paramidani, M., Assis, R., Morrris, W., Mivakawa, M.F. (2003) Outbreak of Clostridial myocarditis in calves. Vet Rec. 152: 134-136.

Wilson, G.S., Miles, A.A. (1975) Topley and Wilson’s Principles of Bacteriology, Virology and Immunology. (6th ed.). The Williams and Wilkins Co, Baltimore, Maryland, USA.