Document Type : Genetic and Toxicology

Authors

1 Department of Comparative Biosciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Department of Research and Technology, Kerman branch, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kerman, Iran

3 Department of Proteomics and Biochemistry, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

10.22059/ijvm.2021.327183.1005185

Abstract

BACKGROUND: The high potential toxicity of epsilon toxin (Etx) produced by Clostridium perfringens (C. perfringens) type D, has made it the third most lethal clostridial toxin behind botulinum and tetanus, therefore, having a pure and concentrated Etx is very important.
OBJECTIVES: The aim of this study was to purify Etx as pure as possible with an applicable, cost-effective, multistep purification protocol with the lowest and shortest time.
METHODS: The purification of the Etx was carried out in multiple consecutive steps; ammonium sulfate precipitation, dialysis, size exclusion chromatography by G50, two concentration steps, and ultrafiltration. The Etx activity after different steps was evaluated by the minimum lethal dose (MLD) calculation, according to the standard operating procedure. Toxin quantification was determined using Lowry technique, and its presence and specificity was tracked to identify pure Etx by SDS- PAGE and western blotting. Finally, the purity of Etx was evaluated by capillary electrophoresis.
RESULTS: The purified Etx formed a single band of about 32.9 kDa in SDS-PAGE and blotting. The pure Etx concentration was calculated to be 3.9 mg/ml and its MLD value was the dilution of 1/24000 after the ultrafiltration step. The presented purification processes to purify Etx resulted in ~ 87-fold concentration and 88.6% purity.
CONCLUSIONS: Due to this high Etx purity, the processes used in this study can provide the technical knowledge of toxin production in a larger industrial scale that can be used in development of clostridial toxoid vaccines, as well as quality control and/or diagnostic tests.

Keywords

Article Title [فارسی]

یک روش کاربردی نوین برای تخلیص توکسین اپسیلون باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ D، توسط کروماتوگرافی اندازه طردی (SEC) و اولترافیلتراسیون (UF)

Authors [فارسی]

  • مکرمه پودینه معرف 1
  • محمد کاظم کوهی 1
  • مجتبی علی ملایی 2
  • تارا امامی 3
  • جلال حسن 1

2 گروه تحقیقات و فناوری، واحد کرمان، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، کرمان، ایران

3 گروه پروتئومیکس و بیوشیمی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، کرج، ایران

Abstract [فارسی]

زمینه مطالعه: سمیت بالقوه بالای توکسین اپسیلون تولید شده توسط باکتری کلستریدیوم پر فرنژنس ((Clostridium perfringens تیپ D، آن را به سومین سم کشنده کلستریدیال پس از بوتولینوم و کزاز تبدیل کرده است، بنابراین داشتن توکسین خالص و غلیظ اهمیت زیادی دارد.
هدف: هدف از این مطالعه خالص سازی توکسین اپسیلون تا حد ممکن با اجرای پروتکل های کاربردی، مقرون به صرفه، چند مرحله ای و در کمترین زمان بود.
روش کار: تصفیه توکسین اپسیلون در چندین مرحله متوالی انجام شد; رسوب سولفات آمونیوم، دیالیز، کروماتوگرافی اندازه طردی با استفاده از ستون Sephadex-G50 ، دو مرحله تغلیظ و اولترافیلتراسیون. فعالیت توکسین اپسیلون پس از مراحل مختلف با توجه به روش عملیاتی استاندارد با محاسبه حداقل دوز کشنده (MLD) تعیین شد. میزان توکسین با استفاده از روش Lowry و حضور و اختصاصیت آن نیز توسط SDS-PAGE و وسترن بلات پیگیری شد. در نهایت، ارزیابی خلوص توکسین اپسیلون با اجرای الکتروفورز مویرگی صورت گرفت.
نتایج: توکسین اپسیلون خالص یک باند واحد، در حدود 32.9 کیلو دالتون در SDS-PAGE و وسترن بلات تشکیل داد. غلظت خالص توکسین اپسیلون، mg/ml3.9 محاسبه شد و میزان MLD آن، رقت 24000/1 پس از مرحله اولترافیلتراسیون بود. فرآیندهای تصفیه ارائه شده جهت تخلیص توکسین، منجر به تغلیظ آن تا fold 87 و خلوص 88.6 درصد شد.
نتیجه گیری نهایی: با توجه به خلوص بالای توکسین اپسیلون، فرایند های مورد استفاده در این مطالعه می تواند دانش فنی تولید توکسین در مقیاس صنعتی را فراهم کند که می تواند در تولید واکسن توکسوئید کلستریدیدیال، همچنین کنترل کیفیت و یا آزمایشات تشخیصی استفاده شود.

Keywords [فارسی]

  • کلستریدیوم پرفرنژنس
  • توکسین اپسیلون
  • تخلیص
  • تغلیظ
  • خلوص بالا